重組抗體技術(shù)正日益成為產(chǎn)生高度特異的、定制的、生物識別元素的首選方法。越來(lái)越多的重組抗體被開(kāi)發(fā)出來(lái)，適用于環(huán)境分析、診斷和治療（僅舉幾例），因此人們期待的重組抗體庫的擴展正在實(shí)現。
對于他們的有序定位仍然存在許多挑戰，因為通常減少抗體的面積會(huì )減少可用于連接的反應點(diǎn)的數量。然而，通過(guò)研究開(kāi)發(fā)的許多策略已經(jīng)確定了有序固定重組抗體片段的方法，但這通常是通過(guò)隨機功能化實(shí)現的，這可能影響抗體抗原的活性。
Townsend和他的同事證明了重組抗體片段的結構形式和芯片功能化對小型非法藥物結合物的檢測有影響。這說(shuō)明在基于SPR的分析中，格式和抗體會(huì )影響檢測的靈敏度。融合蛋白作為固定化的媒介，在一些真正有序取向的應用中被證明是有用的。
為了快速色譜的目的，Blank和他的同事贊成使用甲殼素結合域（CBD）?？贵w和CBD的融合允許直接從粗制的細菌裂解液中固定在甲殼素涂層的珠子上。
在首先突變CBD中自然存在的半胱氨酸以達到最大的細菌表達量之后，每個(gè)抗體分子使用一些CBD來(lái)實(shí)現固定化抗體的高穩定性。
這樣的方法可用于免疫分析表面的抗體固定化，并結合了快速純化和快速功能化。Kwon和他的同事證明了角蛋白酶介導的SAMs在抗體陣列上的潛力，它能保持抗體的反應性。
在該研究中，絲氨酸酯酶與表面結合的膦酸酯配體形成了一個(gè)特定位點(diǎn)的共價(jià)加合物。
在基于SPR的分析中，一些蛋白質(zhì)被固定下來(lái)，也被證明在基于熒光的微陣列中是有效的。作者展示了一種制備具有可控抗體密度的相關(guān)芯片的操作策略。Scholler和同事們利用酵母交配來(lái)產(chǎn)生體外生物素化的抗體片段。
這些【生物抗體】是通過(guò)首先篩選抗HE4 scFv（卵巢癌標志物）庫，然后與攜帶生物素連接酶序列的單倍體酵母交配產(chǎn)生的。生成的構建體很容易用于生物素化的生物堿表面，利用鏈霉菌素上的多個(gè)生物素結合位點(diǎn)來(lái)捕獲生物體，以確定其特征。
在一個(gè)類(lèi)似的方法中，Even- Desrumeaux和他的同事開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于珠子的夾心試驗，使用新型的單域抗體片段（sdAbs），即來(lái)自駱駝的VHH域抗體。
在這項研究中，在大腸桿菌中實(shí)現了體內生物素化，促進(jìn)了細菌裂解物的直接點(diǎn)化，以開(kāi)發(fā)高通量的基于抗體的診斷陣列為目的的三明治測定。這種基于珠子的方法具有復用的潛力，對于低密度的臨床診斷陣列是一種有吸引力的方法。
描述了用于檢測阿特拉津污染的【可調控】免疫吸附劑，并利用了隨著(zhù)溫度變化從可溶性到聚集性的可逆相變。
Kim和他的同事將彈性蛋白樣多肽（EPL）與單鏈抗體（scAb）相融合，這有利于融合后的抗體在競爭性試驗中與莠去津抗原相分離，而不需要固定試驗中的任何元素。使用融合抗體進(jìn)行的檢測比單獨使用scAb進(jìn)行的相同檢測的靈敏度高10倍。
這種方法規避了將聚合物與抗體進(jìn)行化學(xué)連接的需要。然而，在這種情況下，ELP被融合在scAb的N端。為了使連接物遠離結合位點(diǎn)，也許C端融合到人類(lèi)Ck鏈上將是有意義的，特別是如果為涉及較大的抗原（如蛋白質(zhì)）的檢測而開(kāi)發(fā)。
SNAP-標簽利用了O（6）-烷基鳥(niǎo)嘌呤DNA烷基轉移酶的快速、特異性偶聯(lián)，從而使含有O（6）-芐基鳥(niǎo)嘌呤的底物通過(guò)硫醚鍵共價(jià)結合。Kampmeier和他的同事所展示的方法旨在憑借共軛作用擴大小型抗體片段的效用，而不影響結合。
這種方法已經(jīng)成功地在一些場(chǎng)合得到了證明，從引入熒光體成像到熒光激活細胞分選（FACS），此外還有對非抗體配體（如CD40L）的標記。
利用游離半胱氨酸的反應性是有序固定化的一個(gè)有用方法。Brockmann和他的同事在scFv和Fab構建體中設計了一個(gè)游離半胱氨酸，以開(kāi)發(fā)刺激甲狀腺激素（TSH）的有序片段檢測。
游離半胱氨酸與馬來(lái)酰亞胺PEO2-生物素反應，并通過(guò)與鏈霉菌素的相互作用組裝在表面。與完整的單克隆相比，表面結合的scFv和Fab分子能夠敏感地檢測TSH。
原因可能是與全長(cháng)抗體相比，每單位面積的功能化表面可以捕獲更多的scFv和Fab，從而允許捕獲更多的抗原。在這種情況下，進(jìn)行了【一體化檢測】，具有良好的檢測限。Liu和他的同事利用游離半胱氨酸進(jìn)行基于scFv的Au納米粒子的聚集。
在這種情況下，半胱氨酸被設計在scFv的連接區[72]。scFv穩定的納米粒子的聚集允許比色檢測，并有可能被應用于使用其他抗原特異性scFv的側流式免疫分析。
另一種有趣的位點(diǎn)特異性方法是利用所謂的第21種氨基酸，硒半胱氨酸（Sec），這是一種半胱氨酸類(lèi)似物，用含硒的硒醇基團代替了含硫的硫醇。
在這種情況下，有關(guān)大腸桿菌中具有游離半胱氨酸殘基的可溶性蛋白質(zhì)的低水平表達的問(wèn)題被克服了。
在重組蛋白中，Sec的定向結合是通過(guò)一個(gè)順式結構下游的UGA密碼子實(shí)現的，該結構在哺乳動(dòng)物系統中被稱(chēng)為硒半胱氨酸插入序列（SECIS），而在原核生物系統中也需要Sel操作子。
這使得其他重要的半胱氨酸殘基得以保存，并允許加入一個(gè)有針對性的/定向的反應性手柄。Hofer和其他人已經(jīng)表達了Fc-Sec變體以證明這種抗體衍生物在哺乳動(dòng)物系統中的效用。
在這種方式下，馬來(lái)酰亞胺化學(xué)被證明在DTT的存在下選擇性地將Sec作為生物素衍生的目標，而在相同條件下不與游離半胱氨酸結合。
Hofer和同事用重組表達的完整的IgG-sec和Fab-sec構建體證明了這種方法，用于與一些具有治療、蛋白質(zhì)組學(xué)和診斷用途的分子相連接。在這種方法中，生物素-碘乙酰胺和生物素-馬來(lái)酰亞胺被連接到抗體-sec重組體。
Rader和他的同事使用雙半胱氨酸和硒半胱氨酸來(lái)允許裝飾scFv-Fc構建體，特別適用于抗體藥物結合物（ADC）。
在這些情況下，抗體與抗原的結合也沒(méi)有被破壞。含有Sec是有利的，因為它有利于特定部位的共軛而不需要還原或修飾，具有很高的親核反應性（共軛效率大于90%），保留了天然的二硫鍵并具有可控的化學(xué)計量。
鑒于許多熒光體和表面都存在共軛所需的化學(xué)反應，將這種蛋白質(zhì)納入免疫測定平臺似乎有潛力。
重組抗體在免疫測定表面的部署正在形成勢頭，因為所選擇的抗體正變得真正的超敏感，并為這種測定格式量身定做。
重組抗體不一定來(lái)自于親代單克隆抗體，而是來(lái)自于幾乎任何物種和天然來(lái)源的免疫復合物。
這些重組抗體被設計成具有高親和力和針對許多重要疾病目標的關(guān)鍵表位，被迅速設計以克服與隨機固定有關(guān)的問(wèn)題。因此，表面變得更加均勻，并含有高容量的功能完整的生物識別分子，以支持更高靈敏度的免疫測定的發(fā)展。
06
結論和未來(lái)展望
蛋白質(zhì)是脆弱的分子，抗體作為生物識別元素，必須在有利于保留其活性的條件下進(jìn)行處理，并促進(jìn)足夠密度的固定在正確的方向上，以支持新型免疫分析的發(fā)展。噬菌體、核糖體和酵母菌展示正在產(chǎn)生用于診斷的新型抗體。
這些重組格式是有優(yōu)勢的。一旦建立，它們可以相對便宜地生產(chǎn)和設計。新的底物表面化學(xué)和連接方法正在推進(jìn)我們部署這些試劑的能力，然而，沒(méi)有一種領(lǐng)先的方法可以滿(mǎn)足所有的分析要求，這對開(kāi)發(fā)免疫測定是至關(guān)重要的。
推進(jìn)我們對表面化學(xué)的認識，整合表面科學(xué)、生物學(xué)和化學(xué)，重點(diǎn)開(kāi)發(fā)與生理有關(guān)的生物材料，對生產(chǎn)下一代免疫測定至關(guān)重要。
在改進(jìn)免疫診斷方法方面已經(jīng)取得了相當大的進(jìn)展，這些進(jìn)展主要集中在表面制備、微流控設計、抗體固定化策略和信號增強方法。
正如所討論的，抗體固定化策略是該過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，對檢測性能有重大貢獻。這些進(jìn)展加上高質(zhì)量、高特異性的抗體，以及一系列人類(lèi)和動(dòng)物健康的重要指標，有可能導致下一代免疫診斷設備的出現。
